Доклад Ольги Рыбиной на конференции по генетике: «Структурно-функциональный анализ гена Lim3, гомолога гена человека LXH3/4, участвующего в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster».
Продолжительность жизни (ПЖ) ограничена практически у всех живых организмов. Но вопрос с помощью каких механизмов поддерживается такое ограничение остается пока без ответа. В связи с этим, становится актуальным выявление новых генов, участвующих в контроле ПЖ, а также определение основных механизмов их влияния на признак.
Ранее мы выявили две группы генов, связанных с неизвестными путями контроля ПЖ Drosophila melanogaster.
Первая группа представлена генами, участвующими в синтезе нейромедиаторов, вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в развитии мотонейронов. К этой группе генов относится ген Lim3.
Lim3 участвует в спецификации мотонейронов, контролирует миграцию их аксонов и играет важную роль в обеспечении правильной мышечной иннервации.
Lim3 кодирует LIM-гомеодоменный белок, который обнаруживает высокий уровень гомологии с другими LIM-гомеодоменными белками, например белком Islet дрозофилы и белками LHX3/4 человека. Наиболее гомологичными являются LIM домены, гомеодомен и LIM3-специфический домен.
Мутации в генах LHX3/4 человека приводят к нарушениям секреции гормонов гипофиза, что является причиной различных нарушений, связанных с репродуктивной системой, ростом и метаболизмом.
Целью нашей работы является исследование роли гена Lim3 в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster.
Ранее было показано, что в развитии мотонейронов важную роль играет транскрипт Lim3A. Однако механизм образования Lim3A и строение его регуляторной области были неизвестны.
Таким образом, первая задача в нашей работы заключалась в том, чтобы определить особенности организации 5′ регуляторной области и инициации транскрипции Lim3А гена Lim3.
Проведенный нами Northern-блот анализ с зондом, захватывающим часть первого экзона Lim3A и часть 5′ регуляторной области, непосредственно примыкающей к нему, показал наличие дополнительного транскрипта размером 2,4 т.п.н. наряду с уже существующим транскриптом Lim3A размером 2,6 т.п.н. Новый, прежде не аннотированный транскрипт был назван Lim3С.
Наличие новой мРНК было подтверждено 5′RACE анализом. 5′RACE показал, что обе мРНК имеют множественные старты транскрипции, с преимущественной инициацией для транскрипта Lim3A в положении -6 и для Lim3С в положении +184 относительно ранее аннотированного старта.
Далее с помощью биоинформатического анализа мы обнаружили различные регуляторные элементы в коровом, проксимальных промоторах обоих транскриптов Lim3A и Lim3С. Так, для Lim3A был найден инициатор и DPE (Downstream core promoter element), которые были идентичны консенсусам соответствующих промоторных элементов генов дрозофилы, а также мотив CAATAA, характерный для генов, экспрессия которых приходится на эмбриональную стадию, а функция связана с развитием нейронов.
Для Lim3С в положении -24-(-18) от его старта была найдена последовательность CAAAAT, которая часто встречается в данном положении в регуляторных областях других генов дрозофилы.
Далее, с помощью программ TFSEARCH, MOTIF были найдены потенциальные сайты связывания ряда транскрипционных факторов. Например, таких как, hunchback, участвующий в специализации ранних нейробластов и Broad-Complex Z3, Z4 (BR-C Z3/Z4), необходимых для нейрогенеза дрозофилы.
Таким образом, было показано, что:
− структура коровой и проксимальной промоторных областей Lim3A, и нового транскрипта Lim3С типичны для транскрипционных факторов РНК полимеразы II, принимающих участие в развитии и функционировании нервной системы дрозофилы.
Следующей задачей было описать молекулярный полиморфизм 5′ регуляторной области и начала структурной области транскрипта Lim3А в природной популяции Drosophila melanogaster.
В нашей работе мы использовали 50 линий, полученные в лаборатории Труди Маккей (Государственный университет Северной Каролины, США). Каждая из этих линий содержала в гомозиготном состоянии вторую хромосому из популяции Raleigh в окружении хромосом изогенной линии Samarkand. Линии достоверно различались по ПЖ, которая варьировала от 22 до 62 дней, (P<0,0001). Для каждой из 50 хромосом была определена последовательность фрагмента ДНК, включающего 5’регуляторную область и первый экзон транскрипта Lim3А, Lim3С, а также следующего за ним часть первого интрона.
Всего было найдено 90 полиморфных маркеров. Уровень полиморфизма оценивали с помощью программы DnaSP и таких показателей как: π – средняя доля нуклеотидных различий между секвенированными вариантами гена и θ – среднее число сегрегирующих нуклеотидов на сайт.
Самым вариабельным оказался дистальный район5’регуляторной области, менее вариабельным оказался проксимальный район регуляторной области и наименее вариабельным оказался экзон.
Низкий уровень полиморфизма в экзоне может свидетельствовать о действии отбора в данном районе. Чтобы проверить это предположение мы провели статистические анализы с использованием D (Tajima, 1989), D* и F* (Fu, Li, 1993), которые оказались достоверно отрицательными для экзона Lim3A. Таким образом, этот результат свидетельствует, что первый экзон Lim3A подвергается действию стабилизирующего отбора. Выявленный при исследовании вариабельности данной области уровень неравновесия по сцеплению между полиморфными маркерами оказался достаточно низким, поэтому можно предположить, что отбор действует именно на полиморфные сайты, расположенные в экзоне, а не какие-либо другие, сцепленные с ними.
Таким образом, в результате проведенной работы было показано, что:
− наименьший уровень изменчивости характерен для кодирующей части экзона, а наибольший – для интрона;
− в исследуемом районе генома наблюдается нормальный уровень рекомбинации;
− первый экзон Lim3A, характеризующийся низким уровнем изменчивости, подвергается действию стабилизирующего отбора.
Следующая задача нашей работы заключалась в исследовании ассоциации между молекулярным полиморфизмом 5′ регуляторной области и начала структурной области транскрипта Lim3А и ПЖ дрозофилы.
Из 90 полиморфных локусов 44 встречались в трех и более линиях. Из них 5 оказались достоверно связаны с ПЖ дрозофилы. Из этих 5 полиморфных локусов два полиморфных маркера образовали гаплотип, достоверно связанный с ПЖ.
Мы предположили, что различные варианты найденного гаплотипа в регуляторной области могут быть связаны с изменением уровня транскрипции гена и таким образом влиять на ПЖ.
Поэтому далее, использовав ОТ-ПЦР в реальном времени, мы оценили количество мРНК Lim3A в 16 линиях с различными вариантами найденного гаплотипа в эмбрионах, головах и семенниках мух.
Оказалось, что гаплотип, достоверно связанный с ПЖ мух, также достоверно связан с транскрипцией Lim3A в эмбрионах, головах и семенниках.
При этом линии с вариантом гаплотипа, которые имеют максимальную ПЖ, характеризуются средним уровнем экспрессии Lim3A и больше представлены в популяции. Линии, в которых экспрессия достоверно выше или ниже оптимума, имеют меньшую продолжительность жизни и меньше представлены в популяции.
Такое распределение по уровню экспрессии было характерно как для эмбрионов, так и для голов и семенников.
Таким образом, показано, что:
− комбинация двух маркеров (G871C и C1177T) в 5’регуляторной области Lim3A, образует гаплотип, наиболее важный, как для ПЖ, так и для экспрессии Lim3A в эмбрионах, головах и семенниках;
− комбинация двух маркеров (G871C и C1177T), ассоциированная с высокой ПЖ и средней экспрессией Lim3A, широко представлена в популяции Raleigh, в то время как комбинация двух маркеров, ассоциированная с низкой ПЖ, являются редкой.
Статистический анализ показал, что между маркерами гаплотипа, достоверно связанных как с транскрипцией, так и с ПЖ, расположены несколько маркеров, достоверно ассоциированных с транскрипцией Lim3A в эмбрионах, головах и семенниках. Мы предположили, что область ДНК, в которой расположены все эти маркеры, является регуляторным элементом, влияющим на транскрипцию Lim3A и, что соответствующие полиморфизмы попадают в сайты связывания белков, ответственных скорее за повсеместную, чем за тканеспецифическую транскрипцию.
Далее с помощью биоинформатического анализа мы предсказали сайты связывания этих белков.
Оказалось, что C1177T-маркер, образующий гаплотип, локализован в сайте связывания белка, взаимодействующего с (CA/TG)9-повтором, являющимся по данным литературы цис-регуляторным элементом. На основании анализа зависимости экспрессии Lim3A от присутствия того или иного нуклеотида в полиморфном сайте мы обнаружили, что этот сайт связан с активацией транскрипции Lim3A.
Другой полиморфный маркер G871C, также образующий выявленный нами значимый гаплотип, попадает в мотив связывания транскрипционного фактора Grainy Head, принимающего участие в развитии нервной системы. Согласно анализу, этот сайт, напротив, попадает в мотив связывания белка-репрессора.
Известно, что Grainy Head может взаимодействовать с Polycomb-group белками (Dring, Pho). Сайты связывания Grh часто обнаруживаются в составе Polycomb response elements (PREs), рядом с мотивами связывания белков GAGA (GAF), Pho (pleiohomeotic), SP1(specificity protein-1), которые также были обнаружены в регуляторной области Lim3A.
Например, в сайт связывания SP1 попадает маркер G1021A, достоверно ассоциированный с экспрессией Lim3A.
Таким образом,
− мы предполагаем, что обнаруженный регуляторный элемент, расположенный на расстоянии от 380 до 680 п.н. выше старта транскрипции Lim3A осуществляет позитивно-негативную регуляцию транскрипции Lim3A при участии белков групп Trithotax и Polycomb.
В сайте связывания SP1 находится маркер G1021A, достоверно ассоциированный с экспрессией Lim3A. Известно, что Sp1 принимает участие в регуляции транскрипции LHX3 гена человека, гомолога гена Lim3 дрозофилы. Также он участвует в ремоделировании хроматина как белок-активатор, являясь членом группы белков Trithorax, однако может действовать и как белок-репрессор, являясь членом белков группы Polycomb. Можно предположить, что Sp1, функционирует совместно с транскрипционными факторами Grainy Head и CA-связывающим белком, в сайтах связывания которых находятся маркеры, образующие гаплотип.
Обнаруженные нами сайты связывания различных белков, характерных для Polycomb/Trithorax response элементов могут свидетельствовать о наличии такого элемента в 5’регуляторной области Lim3A и его роли в поддержании активного и неактивного транскрипционного состояния гена Lim3.
Таким образом, в результате проведенной работы было показано, что:
− в геноме особей из природной популяции Raleigh комбинация двух маркеров, расположенных в 5’регуляторной области Lim3A, G871C и C1177T, образует гаплотип, связанный с уровнем транскрипции Lim3A в эмбрионах, головах и семенниках;
− вариант гаплотипа, ассоциированный со средним уровнем транскрипции, широко представлен в популяции Raleigh, в то время как варианты гаплотипа, ассоциированные с высоким и низким уровнем транскрипции, являются редкими;
− область ДНК, расположенная на расстоянии от 380 до 686 п.н. выше мажорного старта транскрипции Lim3A играет важную роль в регуляции общего, нетканеспецифического уровня экспрессии Lim3A;
− полиморфные маркеры, расположенные в этой области, находятся в предполагаемых сайтах связывания различных транскрипционных факторов.
Расскажите о нас друзьям
