Синтетические моноклональные антитела

Опубликовано Июл 9, 2012 в Новости, технология

В 1975 году, когда Кёлер и Мильштейн опубликовали статью о методе получения гибридом и предположили, что этот метод может быть использован в медицине и промышленности, мало кто верил в возможность практического применения моноклональных антител. Как ни курьёзно это сейчас звучит, в ответе, полученном Мильштейном из национальной корпорации по исследованиям и разработкам в 1976 году, была фраза: «Нам, несомненно, трудно сейчас определить непосредственные практические применения [метода гибридом], которые имели бы коммерческий потенциал…». В наши дни моноклональные антитела стали одним из необходимых реагентов в биологической лаборатории, а объёмы продаж лекарств, созданных на их основе, превышают миллиарды долларов. Развитие каких технологий сделало возможным такое широкое их применение? Этот раздел статьи посвящен истории создания популярного современного метода получения моноклональных антител, который пришёл на смену технологии гибридом, и виртуозному применению синтетических моноклональных антител для решения научных проблем.

Описанный выше метод гибридом позволил получать неограниченное количество моноклональных антител, специфичных к одной детерминантной группе. Их широкое применение в медицине и иммунологии поставило новые задачи:

1. Мышиные антитела плохо подходят для использования в клинической практике — они вызывают иммунный ответ в организме человека точно так же, как введённый антиген приводит к выработке антител у мышей, из-за чего они быстро удаляются из организма. Стремление создать полностью человеческие антитела для клинической практики стало стимулом для разработки новых технологий.
2. Иммунизация — необходимое условие для получения гибридомы, но не все молекулы могут легко активировать АОК. Например, они могут быть слишком токсичны для введения мышам. Каждая гибридома производит антитело только к одной детерминанте, но не всегда можно выбрать антитела с необходимой специфичностью к нужному белку даже из большого количества гибридом. Например, у исследователя могут быть такие требования к антителам: специфически связываться только с одним из двух похожих белков или узнавать только одну конформацию белка. Получить такие антитела при помощи метода гибридом очень трудно, потому что при иммунизации антитела могут вырабатываться к антигенным детерминантам, которые одинаковы у двух белков, так как они расположены на поверхности и более доступны для связывания антител. Требовался новый метод, который бы позволил получать антитела нужной аффинности и специфичности, не прибегая к иммунизации мышей.

Появление такого метода стало возможном благодаря развитию нескольких научных направлений. Прежде всего этому способствовал прогресс в понимании структуры и функции антител. Какой механизм обусловливает высокую аффинность и специфичность антител, которые производит гибридома? Во время дифференцирования B-лимфоцитов (в процессе соматической генетической рекомбинации) нуклеотидная последовательность гена, кодирующего вариабельный домен B-клеточного рецептора, собирается из нескольких сегментов (см. врезку). Эта последовательность уникальна у каждой B-клетки, как и рецепторы на её поверхности. Когда B-клетка узнаёт свой антиген, она активируется и становится АОК, часть из которых сразу начинает производить антитела низкой аффинности. Рецепторы других АОК проходят процесс аффинного созревания, в результате которого аффинность и специфичность рецептора АОК, а, следовательно, и антител, повышается.

Аффинное созревание основано на соматической гипермутации, в процессе которой в последовательности вариабельных доменов рецепторов специальные белки вносят 1–5 мутаций на каждое деление клетки. Большинство мутаций приводит к тому, что B-клетка перестает узнавать антиген и погибает. Редкие мутации повышают аффинность рецептора к антигену (такие мутации накапливаются в CDR-участках), и B-клетки, несущие такие рецепторы, выживают, размножаются и производят антитела с высокой аффинностью и специфичностью. К сожалению, этот процесс ещё недостаточно хорошо изучен, чтобы его можно было контролировать в пробирке и таким образом получать антитела с нужной специфичностью.

Развитие методов генной инженерии привело к появлению новых возможностей: вариабельные и константные участки генов, кодирующих антитела, можно комбинировать в пробирке, вносить в них мутации, отбирать необходимые варианты и экспрессировать в бактериях. Так можно получать антитела с нужными свойствами, не иммунизируя мышей. Для того чтобы это стало реальностью, сначала надо было создать библиотеки вариабельных доменов антител. Начало этому было положено в 1989 году, когда соответствующие гены были выделены из пяти гибридом и из активированных клеток селезёнки иммунизированных мышей. Эти гены были клонированы, и были определены их нуклеотидные последовательности. В настоящее время для создания библиотек используют вариабельные домены наивных (неактивированных) лимфоцитов мышей или человека и даже комбинируют фрагменты природных вариабельных доменов с синтезированными человеком.

В 1988 году Fab-фрагмент антитела впервые был экспрессирован в бактерии. Чтобы создавать антитела без использования гибридом, оставалось решить последнюю задачу: физически связать между собой антитело и кодирующий его ген, тогда выбрав из библиотеки антитело, специфичное к данной молекуле, можно клонировать его ген для экспрессии в бактерии и получать нужное количество антител. В 1990 году Г. Винтер и соавторы встроили в геном бактериофага нуклеотидную последовательность Fab-фрагмента антитела, объединив его с частью гена поверхностного белка III этого фага [8]. Это позволило экспрессировать на поверхности каждой вирусной частицы несколько копий этого гибридного белка, сохраняющего специфичность к своему антигену, — а значит, можно было проводить селекцию нужного антитела из фаг-дисплейной библиотеки (рис. 4). Один раунд селекции может увеличить частоту фага, специфичного к данному антигену, в 1000 раз. За несколько раундов можно из большой популяции выделить редкие фаги, специфичные к данному антигену, извлечь из них ДНК, определить нуклеотидную последовательность и клонировать для получения антител в бактерии.

Кристаллографические структуры комплексов антиген—антитело позволили понять принципы организации, стоящие за кажущимся бесконечным разнообразием природных антител. Например, за исключением CDR-участков, структура антител довольно консервативна: известно всего несколько десятков различных структур, некоторые из которых более стабильны и встречаются в природных антителах чаще. При создании современных фаг-дисплейных библиотек выбирается одна наиболее стабильная структура вариабельных доменов тяжёлой и легкой цепи, разнообразие аминокислотных остатков CDR-участков создаётся искусственно. Анализ природных антиген-связывающих сайтов антител выявил, что наиболее часто непосредственно взаимодействуют с поверхностью антигена аминокислотные остатки тирозин (Tyr) и серин (Ser), поэтому первые библиотеки синтетических антител получали, варьируя именно эти остатки в ключевых позициях CDR. В последующих поколениях библиотек начали варьировать также остатки, которые не взаимодействуют с поверхностью антигена непосредственно, но влияют на конформацию CDR-участков. Современные библиотеки содержат более 10 миллиардов фрагментов антител с уникальной специфичностью.

Пример успешного применения фаг-дисплейных библиотек — создание моноклональных антител, специфичных к различным конформациям белка убиквитина. В клетке встречаются полимеры убиквитина, связанные через боковые цепи разных остатков лизина (Lys). Lys48-связанные полимеры «помечают» белки, предназначенные для деградации в протеасомах, а Lys63-связанные цепи играют важную роль во многих клеточных процессах, — например, способствуют образованию сигнальных платформ рецепторов, включая рецептор фактора некроза опухолей 1 и рецептор интерлейкина 1 (ИЛ-1) (рис. 5). Для исследования убиквитиновых модификаций применялись дорогостоящие и трудоёмкие методы (такие как масс-спектроскопия), которые не позволяли следить за их быстрыми изменениями. Моноклональные антитела, специфично узнающие разные конформации полимеров убиквитина, стали бы незаменимым реагентом для исследования многих клеточных процессов. Долгое время попытки получить такие антитела были безуспешны.

Вишва Диксит и соавторы использовали фаг-дисплейные библиотеки для получения специфичных антител к Lys48- и Lys63-связанным полимерам убиквитина [13]. После четырех раундов из библиотеки были отобраны фрагменты антител, которые не связывались с моноубиквитином и были специфичны исключительно к Lys63- или Lys48-связанным полимерам, причем с наномолярной аффинностью. Выбранные антитела экспрессировали в бактериях и определили их аминокислотные последовательности. У антител к Lys48-связанным полимерам убиквитина вариабельность аминокислотных остатков была сконцентрирована в CDRH3, поэтому для повышения их аффинности в этот же участок внесли дополнительные мутации. Полученные после повторного отбора антитела к Lys48-связанным полимерам обладали очень высокой аффинностью (1.2 нМ).

Оптимизация антител к Lys63-связанным цепям потребовала, напротив, значительных усилий. Сначала, перед повторным отбором, мутации были внесены в CDRH1 и CDRH2, но аффинность полученных антител была на порядок ниже, чем у антител к Lys48-связанным цепям убиквитина. Для дальнейшей оптимизации была получена пространственная структура К63-связанных димеров убиквитина в комплексе с антителами, которая показала, что значительная часть паратопа составлена аминокислотными остатками CDRH2 и CDRL2, в которые и были внесены дополнительные мутации. Отобранные антитела имели высокое сродство к Lys63-связанному полимеру (6–7 нМ) и не связывались с другими конформациями убиквитина. Кристаллическая структура нового комплекса показала, что мутированные аминокислотные остатки не контактируют с поверхностью убиквитина, а повышение специфичности объясняется улучшением электростатической совместимости между поверхностями антигена и антитела.

Полученные антитела могут быть использованы для иммунопреципитации белков, модифицированных различными полимерами убиквитина, из клеточных лизатов, или для иммуннофлуоресцентного окрашивания клеток, что позволяет получить информация о пространственной организации модифицированных белков. С их помощью исследователям удалось проследить за быстрыми изменениями модификаций адаптерных белков в сигнальном каскаде, инициированном рецептором фактора некроза опухолей (ФНО) на поверхности клетки. Через пять минут после связывания ФНО со своим рецептором, киназа RIP1, модифицировнная К63-связанными полимерами убиквитина, связывается с рецептором. К63-полимеры убиквитина необходимы для взаимодействия с другими белками и передачи сигнала. Уже через 10 минут деубиквитиназа А20 начинает заменять К63- на К48-полимеры убиквитина, что приводит к деградации сигнального комплекса и прекращению сигнала (рис. 5). Такая же замена Lys63- на Lys48-связанные полимеры убиквитина происходит и во время передачи сигнала от других рецепторов, таких как рецептор ИЛ-1 и некоторых Толл-рецепторов. Время передачи сигнала варьирует в зависимости от рецептора: в случае рецептора ИЛ-1 замена K63→K48 происходит только через 30–60 минут после связывания лиганда.

Приведённый пример показывает, что развитие современных методов производства моноклональных антител превратило их в чрезвычайно точный научный инструмент, с помощью которого будет сделано ещё немало интересных открытий.

 Источник: http://biomolecula.ru/content/1076